Pengamatan bakteri dengan mikroskopik tanpa pengecatan, akan menyulitkan dalam mengidentifikasi kuman tersebut. Dengan pengecatan maka struktur sel bakteri dapat dilihat lebih seksama. Fungsi pengecatan terutama memberi warna pada sel atau bagian lain, sehingga menambah daya kontras dan tampak lebih jelas. Terdapat dua macam zat warna (bahan cat) yang sering dipakai yaitu : zat warna yang bersifat asam ; komponen warnanya adalah anion, biasanya dalam bentuk garam natrium, dan zat warna yang bersifat alkalis dengan komponen warna kation, biasanya dalam bentuk klorida. Setelah dilakukan pengecatan, dalam tubuh bakteri akan terjadi proses pertukaran ion-ion zat warna dengan ion-ion protoplasma (asam nukleat) bakteri). (18).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pengecatan adalah:
II.5.1. Fiksasi
Sebelum bakteri dicat, preparat dahulu dilakukan tindakan fiksasi. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik pemanasan. Cara fiksasi yang paling banyak dalam pengecatan bakteri, yaitu dengan membuat lapisan suspensi bakteri diatas objek glass, kemudian dikeringkan dilakukan beberapa kali diatas nyala api spiritus.
Pada umumnya fungsi dari tindakan fiksasi adalah:
•Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel.
•Merubah afinitas sel.
•Mencegah terjadinya otolisis sel.
•Dapat membunuh kuman secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan bentuk dan stuktur sel.
•Melekatkan kuman diatas kaca objek.
•Membuat sel lebih kuat dan keras.
II.5.2 Substrat.
Cat basa dan cat asam dapat bereaksi dengan konstituen sel tertentu, oleh karna itu substrat organik seperti lipida, protein, asam nukleat dan karbohidrat juga akan mempengaruhi proses pengecatan.
II.5.3 Peluntur cat.
Peluntur cat digunakan untuk mendapatkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Umumnya sel-sel yang sukar dicat akan lebih sukar untuk dilunturkan (pengecatan TB). Sebaliknya sel yang mudah di cat akan lebih mudah pula dilunturkan. (14).
II.6. Metode Ziehl Nielsen
BTA adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol fuksin (zat warna pertama) dan dilunturkan dengan menggunakan asam, maka karbol fuksin yang melekat pada dinding sel bakteri selain BTA akan luntur. Oleh karena itu, penggunaan methylen blue berperan untuk memberikan warna pada bakteri yang tidak tahan asam. (18).
II.6.1 Cara Pembuatan Larutan Carbol Fuchsin 0.3%
•Basic fuchsin : 0.3 gram
•Alkoholk 95% : 10 ml
•Air Suling : 85 ml
•Fenol : 5 ml
Basik fuksin digerus dalam mortal sampai hancur, kemudian dilarutkan dalam alkohol, ditambahkan air suling dan fenol, dikocok dan disaring kedalam botol yang berwarna.
II.6.2 Cara Pembuatan HCl Alkohol 3%
•HCl pekat : 3 ml
•Alkohol 95% : 97 ml
II.6.3 Cara Pembuatan Methylen Blue 0,3%
•Methylen blue : 0.3 gram
•Air suling : 100 ml
Methylen blue digerus dalam mortal sampai hancur, ditambahkan sedikit air suling sambil digerus sampai methylen blue larut.
II.7 Metode Kinyoun Gabbet.
II.7.1 Cara Pembuatan Kinyoun
•Mula-mula basik fuksin ditimbang sebanyak 4 gram (digerus)
Dimasukkan fenol 8 ml ke dalam labu ukur 100 ml
•Dicampur, jangan sampai menggumpal (harus larut semua) lalu tambahkan alkohol absolut 95% sebanyak 20 ml
•Ditambahkan aquades steril sampai batas 100 ml
II.7.2 Cara pembuatan Gabbet (dalam 100 ml)
•Methilen blue 1 gram, lalu digerus, dimasukan dalam labu ukur, dibilas dengan aquades yang telah tersedia 50 ml
•Setelah larut semua, lalu dicampur dengan alkohol–H2SO4 (yaitu 20 ml H2SO4 pekat + 30 ml alkohol absolut) diputar perlahan-lahan, sedikit demi sedikit. (19).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pengecatan adalah:
II.5.1. Fiksasi
Sebelum bakteri dicat, preparat dahulu dilakukan tindakan fiksasi. Cara yang paling banyak digunakan adalah cara fisik pemanasan. Cara fiksasi yang paling banyak dalam pengecatan bakteri, yaitu dengan membuat lapisan suspensi bakteri diatas objek glass, kemudian dikeringkan dilakukan beberapa kali diatas nyala api spiritus.
Pada umumnya fungsi dari tindakan fiksasi adalah:
•Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel.
•Merubah afinitas sel.
•Mencegah terjadinya otolisis sel.
•Dapat membunuh kuman secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan bentuk dan stuktur sel.
•Melekatkan kuman diatas kaca objek.
•Membuat sel lebih kuat dan keras.
II.5.2 Substrat.
Cat basa dan cat asam dapat bereaksi dengan konstituen sel tertentu, oleh karna itu substrat organik seperti lipida, protein, asam nukleat dan karbohidrat juga akan mempengaruhi proses pengecatan.
II.5.3 Peluntur cat.
Peluntur cat digunakan untuk mendapatkan kontras yang baik pada bayangan mikroskop. Umumnya sel-sel yang sukar dicat akan lebih sukar untuk dilunturkan (pengecatan TB). Sebaliknya sel yang mudah di cat akan lebih mudah pula dilunturkan. (14).
II.6. Metode Ziehl Nielsen
BTA adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol fuksin (zat warna pertama) dan dilunturkan dengan menggunakan asam, maka karbol fuksin yang melekat pada dinding sel bakteri selain BTA akan luntur. Oleh karena itu, penggunaan methylen blue berperan untuk memberikan warna pada bakteri yang tidak tahan asam. (18).
II.6.1 Cara Pembuatan Larutan Carbol Fuchsin 0.3%
•Basic fuchsin : 0.3 gram
•Alkoholk 95% : 10 ml
•Air Suling : 85 ml
•Fenol : 5 ml
Basik fuksin digerus dalam mortal sampai hancur, kemudian dilarutkan dalam alkohol, ditambahkan air suling dan fenol, dikocok dan disaring kedalam botol yang berwarna.
II.6.2 Cara Pembuatan HCl Alkohol 3%
•HCl pekat : 3 ml
•Alkohol 95% : 97 ml
II.6.3 Cara Pembuatan Methylen Blue 0,3%
•Methylen blue : 0.3 gram
•Air suling : 100 ml
Methylen blue digerus dalam mortal sampai hancur, ditambahkan sedikit air suling sambil digerus sampai methylen blue larut.
II.7 Metode Kinyoun Gabbet.
II.7.1 Cara Pembuatan Kinyoun
•Mula-mula basik fuksin ditimbang sebanyak 4 gram (digerus)
Dimasukkan fenol 8 ml ke dalam labu ukur 100 ml
•Dicampur, jangan sampai menggumpal (harus larut semua) lalu tambahkan alkohol absolut 95% sebanyak 20 ml
•Ditambahkan aquades steril sampai batas 100 ml
II.7.2 Cara pembuatan Gabbet (dalam 100 ml)
•Methilen blue 1 gram, lalu digerus, dimasukan dalam labu ukur, dibilas dengan aquades yang telah tersedia 50 ml
•Setelah larut semua, lalu dicampur dengan alkohol–H2SO4 (yaitu 20 ml H2SO4 pekat + 30 ml alkohol absolut) diputar perlahan-lahan, sedikit demi sedikit. (19).
